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基因扩增仪的原理|分类|应用

2022年09月20日


基因扩增仪

PCR是分子生物学研究极其重要的工具，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制，即人为创造核酸半保留复制条件，使目的DNA在细胞外完成扩增的过程，它可被看作是生物体外的特殊DNA复制。


PCR也叫基因扩增仪，主要用于用于科研及临床的基因扩增、定性PCR基因扩增、荧光/酶免终点定量DNA基因扩增、基因芯片等其他基因分析应用的基因扩增等。基因扩增仪适合国内外各种PCR试剂盒传染病类、肿瘤类、科研类。进口基因扩增仪主要由外壳、变温反应腔、散热系统、加热系统、制冷系统、电子控制系统、供电系统、人机界面等各部分组成。基因扩增仪广泛应用于各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。



“基因扩增仪”的诞生和发展


核酸体外扩增的设想最早是由Khorana在1971年提出的。“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”


然而当时还没有成熟的基因序列分析方法，也没有热稳定DNA聚合酶以及引物合成操作很困难。这种设想达不到实际的效果。并且在70年代初出现了分子克隆技术，一种克隆和扩增基因的途径被提供了，因此人们遗忘了Khorana的设想。


1983年4月的一个星期五晚上， Kary Mullis开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法；


1983年12月，Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的diyi个PCR片段；


1985年， Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼；


1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是diyi发明人；


1985年12月20日在Science杂志上发表了diyi篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者；


1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。


根据PCR原理，商业公司在PCR仪的基础功能上不断进行创新和改进。至今，PCR仪已经更新至第三代技术。为方便读者朋友理解，本文将对三代PCR仪的原理、特点、主要厂商及产品、应用领域做一系统梳理。


第一代——标准PCR仪


标准PCR仪也叫做终点PCR仪，是指目的基因仅经过预变性、变性、退火、延伸阶段产生大量的核酸序列的PCR仪，PE-Cetus公司推出的世界上第一台PCR自动化热循环仪属于此种。根据PCR退火温度和扩增条件(细胞内/外)，标准PCR又可以分为三类：普通PCR、梯度PCR和原位PCR。

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第二代——qPCR(实时定量PCR)


1996年Applied Biosystems(现被赛默飞收购)公司推出了实时荧光定量PCR(RTFQ PCR)技术，并发明了世界上第一台荧光定量PCR仪，开始了从定性到定量的跨越。

实时定量PCR仪是指在PCR反应体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料(SYBR Green等)或荧光标记的特异性的探针(TaqMan Probe等)，在普通PCR仪设计基础上增加荧光信号激发和采集系统和计算机分析处理系统，形成了具有荧光定量PCR功能的仪器，通过对PCR过程中产生的荧光信号积累实时监测整个PCR过程，再结合相应的计算机软件对所获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品特定DNA片段的初始浓度。

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第三代——dPCR(数字PCR)


不同于qPCR 对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字 PCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。

数字PCR是一种基于PCR反应(聚合酶链反应)的单分子绝对定量技术。如图1，在数字PCR的过程中：

(a) PCR反应体系(含有荧光染料或探针)被分割为数以万计的均一微液滴，

(b) 其中部分微液滴内会含有一个或多个模板，

(c) 将这些微液滴收集到试管内进行PCR反应，其中含有模板的微液滴会产生扩增产物，由此具有较强的荧光，成为阳性微液滴，

(d) 在PCR反应完成后，依次对每个微液滴内的荧光进行检测，

(e) 根据微液滴信号的峰值高度，绘制出微液滴荧光分布的散点图，

(f) 通过合理的荧光分类阈值将微液滴内的荧光强度数字化，判断出其中具有较强荧光的阳性微液滴(图1f中绿色的数据点，称为“1”)和具有较弱荧光的阴性微液滴(图1f中蓝色的数据点，称为“0”)，并通过“1”和“0”的个数来实现绝对定量。因此，与实时定量PCR不同，数字PCR不需要使用标准曲线，即可直接对核酸拷贝数的绝对值进行定量。

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基因扩增仪原理

基因扩增仪是利用PCR技术对特定基因做体外的大量合成，用于以检测DNA/RNA为目的的各种基因分析。

　　PCR反应一般设置20~40次循环，每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板。PCR的扩增效率很高，如果循环次数是30次，那么新生DNA片段理论上达到230拷贝(约为109个分子)。PCR反应每个循环的三个基本反应步骤如下：

　　①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA产物解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;

　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

　　③引物的延伸：温度升到72℃左右，DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

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基因扩增仪的用途


基因扩增仪灵敏度高，操作起来简便、快捷，加上对特定基因样本纯度要求低，因而被广泛地运用在以下检测活动中:

　　1、医学和健康检验机构临床诊断，用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断以及基因复制。

　　2、DNA鉴定，常见于司法鉴定领域。

　　3、临床分子诊断试剂和生物试剂公司药品研发。

　　4、转基因、微生物、动物源性成分检测，常见于医药卫生及农产品检验领域。


基因扩增仪的分类

基因扩增仪一般有四种类型，分别是普通基因扩增仪，梯度基因扩增仪，实时荧光定量基因扩增仪和原位基因扩增仪。这四种基因扩增仪的一般原理有相似的地方，但在结构和配件方面还存在一些差异。


普通基因扩增仪

　　一般把一次PCR扩增扩增只能运行一个特定退火温度的基因扩增仪，叫传统基因扩增仪，也叫普通基因扩增仪。如果要做不同的退火温度需要多次运行。

　　普通基因扩增仪主要是做简单的，对目的基因退火温度的扩增。可用于科研研究，教学，医学临床，检验检疫等机构。


结构上由主机，加热模块，PCR管样品基座，热盖，控制软件组成。


梯度基因扩增仪

　　一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(通常12种温度梯度)的称之为梯度基因扩增仪。因为被扩增的不同的DNApian段其Z适合的退火温度不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的Z适合退火温度进行有效的扩增。

　　基因扩增仪主要用来研究未知DNA退火温度的扩增，这样既节约时间，也节约经费。在不设置梯度的情况下亦可当做普通基因扩增仪用。正真的梯度基因扩增仪，是每一排管都有精确的加热控温探头，2009年为止只有美国ABI公司可以做到。其他的基因扩增仪都是从两头的热传递来设计控温。目前，梯度基因扩增仪多应用于科研、教学机构。


结构上除具有普通基因扩增仪的结构外，还具有特殊的梯度模块，可实现对梯度温度和梯度时间等参数的调整。因此可以在一次实验中对不同样品设置不同的退火温度和退火时间，从而可在短时间内对PCR实验条件进行优化，提高PCR科研效率。


原位基因扩增仪

　　原位基因扩增仪是用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪。如病原基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。可保持细胞或组织的完整性，使基因扩增反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置进行基因扩增。不但可以检测到靶DNA，还能标出靶序列在细胞内的位置。于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有着重大的实用价值。


结构上和普通基因扩增仪相比，用玻片代替了PCR管，其反应过程是在载玻片的平面上进行的。


实时荧光定量基因扩增仪

　　实时荧光定量基因扩增仪是在普通基因扩增仪设计基础上，增加荧光信号激发和采集系统和计算机分析处理系统，形成了具有荧光定量PCR功能的仪器。其PCR扩增原理和普通PCR扩增原理相同，在PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统，得出量化的实时结果输出。

　　实时荧光定量基因扩增仪有单通道，双通道和多通道之分。当只用一种荧光探针标记的时候，选用单通道;有多种荧光标记的时候使用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记和目的基因表达产物，因为一次只能检测一种目的基因的扩增量，需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR，实现一次检测多种目的基因的功能。

　　实时荧光定量基因扩增仪主要应用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业、科研院校等。



结构上在普通基因扩增仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。

　　激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。

　　监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管，前者可以一次对多点成像，后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品，需要通过逐个扫描实现多样品检测，对于大量样品来说需要较长的时间。



荧光定量PCR仪操作规程

因为手上只有荧光定量PCR仪的仪器，所以只能操作荧光定量PCR仪。这次使用的仪器是QuantGene 9600实时荧光定量PCR分析仪，



采用了极为成熟的热电制冷技术，全新的光源和光路设计。独特的恒流电源和6分区独立控温方式，保证了本产品在荧光定量分析上更为快速、准确和稳定，同时兼备低能耗的卓越性能。设计上更加看重客户的体验度，全面实现自动增益，充分满足科学研究和临床医疗的需求。


1.适配App，方便管理与操作；

2.大屏幕触摸式操作面板，单机或PC端均可；

3.模块化设计，多种配置选择；

4. 6分区独立控温；

5.配有SOAK的恒温功能，满足PCR试剂的低温保存需求；

6.全自动探出式样品仓；

7. 6检测通道设计；

8.顶部检测，无需校准；

9.采用全进口高端光纤的集束传导设计，提升荧光信号强度，减少光传导损失；

10.全新的阵列平场光源，提升激发光效应，强化荧光信号；



1.开始运行仪器

将PCR仪底座开关打开，再将定量PCR仪检测器开关打开。在实验之前，首先对系统预热半个小时，打开电脑，将软件启动。

2.放置样品

在0.2ml的薄壁管或96孔板内加入PCR反应体系，将管盖盖上，注意，不要让手指和反应管表面有接触，所以必须将一次性塑料手套戴上。按照顺序在仪器的加热孔中放入反应管。

3.设置程序，运行试验

定量PCR软件的基本操作步骤如下：

（1）对热循环程序文件进行设置。

（2）对反应管文件进行设置。

（3）点击启动键，将程序运行。

（4）数据分析

4.结果分析

（1）PCR反应结束后，标准曲线和Ct值软件会自动计算。

（2）可以在软件窗口选择相应的分析功能进行表达量分析，等位基因分析。

（3）点击右上方的导出键，还能够将结果报告单输出。

5.关闭运行仪器

实验结束后将软件、荧光定量检测器及扩增系统电源关闭，将电脑关闭，将反应管取出。




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