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流式细胞仪-仪器知识 l T淋巴细胞亚群检测，帮助了解你的免疫力！

2022年07月02日

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T淋巴细胞亚群的检测是细胞免疫检测的最新指标之一，随着抗T细胞单克隆抗体的问世及各种检测方法的建立，T淋巴细胞亚群检测已经在基础医学和临床医学研究中得到广泛应用。


01T淋巴细胞亚群及其功能


T淋巴细胞及其分类主要应用抗T细胞表面抗原McAb.根据T淋巴细胞表面分化抗原将成熟T细胞分为CD4+、CD8-和CD4-、CD8+两大亚群，T淋巴细胞的功能与表现型之间的对应关系是相对的，其免疫活性可能受激活“微环境”的影响，并受MHC抗原的制约，许多研究证明，CD4+T细胞具有杀伤活性，介导Ι类抗原不相容时的靶细胞溶解。TU等研究表明，CD4+的细胞毒活性存在两种完全不同的机理，并证明TH1和TH2的细胞毒活性不同。前者强，后者弱或无活性。Dennert等发现，克隆化的T淋巴细胞具有辅助，细胞毒活性和迟发型超敏反应作用，这种功能的多样性有赖于所采用的分析方法。CD4+细胞识别Ⅱ类MHC抗原，其效应的发挥也受Ⅱ类抗原的制约；CD8+细胞识别Ι类MHC抗原，发挥免疫效应也受其控制。


02T细胞亚群的检测方法


人类T细胞亚群的检测方法种类繁多，但大多都是根据T细胞表面抗原与其McAb的特异性反应设计的。根据检查标本的取材及所采用的方法主要分为两大类：

    1、体液中的T细胞亚群的分析；

    2、组织中T细胞亚群的检测。前者包括血液、胸腹腔积液，脑脊液等；后者包括肿瘤浸润细胞，移植物侵润细胞以及炎症浸润细胞等。

    

    一、体液中T细胞亚群的检测方法

一般情况下，体液需要Ficoll-Hypaqu分离富含淋巴细胞的单个核细胞（MNC），然后根据条件选择适宜的免疫学方法检测。


1、酶免疫染色技术：

常规分离MNC，调整细胞浓度为1×105~106个/ml，取细胞用不同亚群的McAb(一抗)和酶标抗体（二抗）或与酶抗体复合链接物，在相应底物作用下显色，普通光镜计数阳性细胞，计算出各亚群的百分比。


2、流式细胞仪：

机体免疫状态是衡量机体是否患病的重要指标，目前多采用流式细胞术检监测机体的免疫状态，其中最重要的指标是检测T、B和NK淋巴细胞的水平。T细胞主要包括T辅助细胞（Th）和T抑制细胞（Ts）细胞亚群。CD3+细胞代表外周血中总的成熟T细胞，理论上应约等CD4+细胞和CD8+细胞的总和，但往往出现CD4+加CD8+细胞之和大于CD3+，这是因为CD4+细胞包括CD3+/CD4+细胞（真正Th细胞）和CD3-CD4+细胞（非Ts细胞），而后者包括CD3-CD8+CD16+CD56+细胞（一部分NK细胞）和CD3-CD8+CD16+CD56-(未知细胞)。由此可见，真正的TH细胞是CD3+CD4细胞，真正Ts细胞是CD3+CD8+细胞。尤其当患者NK细胞明显增加时，会使CD4细胞和CD8细胞的总和大于CD3+细胞，因此，用三色荧光标记才能分析真正的辅助性T细胞和抑制性T细胞。


3、免疫荧光染色法：

MNC悬液的浓度调整至1×107个/ml，可用细胞悬液与抗压群McAb在小试管内是反应，也可将细胞悬液涂片，然后同酶免疫染色操作。根据条件可选择直接法和间接法。T细胞表面抗原直接或间接与荧光抗体结合，通过荧光显微镜或流式细胞仪（FCM）计数。


4、补体杀伤试验：

将淋巴细胞同其McAb(应是细胞毒抗体)作用，加入兔或豚鼠血清（预先选择对淋巴细胞无毒性）提供补体。抗原抗体结合，在补体参与下,T细胞膜受损，通透性增加，然后用活细胞或死细胞染色法染色，光镜计数死细胞百分比，以确定相应T淋巴细胞亚群比例。


5、花环形成试验：

常用的有红细胞花环和细菌花环，通过抗T细胞McAb与T细胞表面抗原结合形成可观察的花环。直接红细胞花环试验：经醛化的红细胞与T细胞McAb连接成指示剂。当淋巴细胞周围结合4个以上红细胞者为阳性细胞。间接红细胞花环试验：以结合了抗鼠IgG的醛化红细胞为指示细胞，淋巴细胞借T细胞McAb同指示细胞结合形成花环，光镜计数，结合3个以上红细胞者为阳性细胞。


SPA菌花环试验：以葡萄球菌为指示剂。SPA同抗T细胞McAb或抗鼠IgG结合，然后直接或者间接与淋巴细胞形成花环，染色后油镜下观察。凡周围连接10个以上葡萄球菌的淋巴细胞为阳性细胞。


二、组织中T细胞亚群的检测

由于淋巴细胞表面抗原比较脆弱，组织切片不宜常规制片，而需采用冰冻切片。常用的方法有酶免疫组织化学方法和免疫荧光技术。如需对T细胞进行定位，可选择分离的淋巴细胞进行分析。


03T细胞亚群检测的临床意义

体液中T细胞亚群的分析和组织内的定位检测作为判断细胞免疫功能的一项重要指标，对恶性肿瘤，自身免疫性疾病，血液系统疾病，同种组织器官移植，以及各种传染病的诊断，发病机理的研究，指导免疫治疗和判断预后等方面平均具有重要意义。外周血T细胞亚群CD3+、CD4+和CD8+的改变常见的有：


一、CD3+细胞数的改变，表示T淋巴细胞总数在外周血MNC中的比例的变化。


1、下降常见于：某些白血病，应用免疫抑制剂，化疗或放疗过程中，长期接受放射性物质，先天性细胞免疫缺陷者，艾滋病，多发性骨髓瘤，传染性单核细胞增多症，某些病毒感染性疾病。


2、增高可见于：重症肌无力，某些自身免疫性疾病，慢性活动性肝炎、系统性红斑狼疮等。


二、CD4+/CD8+细胞比值改变：表明机体细胞免疫功能紊乱。不管是CD4+或CD8+细胞数发生变化均影响该比值。


1、下降是由于CD4+细胞减少或CD8+细胞增多。常见于再生障碍性贫血，某些白血病，骨髓移植后，急性乙型肝炎及无症状携带者，传染性单核细胞增多症，免疫缺陷综合症，艾滋病，某些病毒感染，恶性肿瘤，结核病，同种器官移植排斥阶段等。


2、升高常由于CD4+细胞增多或CD8+细胞减少所致。可见于某些自身免疫性疾病，系统性红斑狼疮。


04评价及发展前景

根据T细胞表面标志，检测T细胞亚群是目前观察机体细胞免疫水平的重要方法之一。但由于T细胞亚群的复杂性，表面标志和功能之间的相对性，以及检测方法的多样性等，所以只根据外周血CD3+，CD4+和CD8+细胞亚群的水平判断机体细胞免疫功能有一定局限性，需要结合具体疾病和病情程度进行综合分析，近年来新的抗T细胞亚群McAb及新型McAb的问世，为T细胞亚群检测的进一步发展提供了可能。

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