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流式细胞仪-仪器知识 l 用6 个流式实验步骤拆解梳理的流式多色方案的技巧

2022年07月04日


1. 了解细胞亚群的标记物，了解抗原密度

流式多色分型实验通过抗原/标记物的表达来识别特定的细胞群体——这就意味着为检测方案挑选合适的标记物至关重要。有些细胞亚群可能只用一到两个标记即可识别，但有些则需要多个标记物来识别和确定。

除了了解和选择合适的细胞标记物外，在设计多色检测方案的时候还需要考虑抗原密度，即选择的标记物在目的细胞亚群的表达水平和该细胞亚群的稀有程度。一般遵循的原则是，把相对亮度高的荧光染料搭配表达丰度低的标记物，而相对亮度低的荧光染料搭配表达丰度高的标记物。主要原因是荧光亮度高的染料的荧光溢出，会直接掩盖并影响邻近通道的低水平荧光，从而影响检测结果。


图 1：相同的人外周血样本，相同的荧光染料偶联的 CD28、CD2、CD3 和 CD45RA 的单染结果。A，CD28 SBV440；B，CD2 SBV440；C，CD3 SBV440；D, CD45RA SBV440。

可以看到，抗原密度最低的 CD28 的 MFI 整体会比 CD45RA 低很多。

2. 确定合适的荧光染料

在确定抗原密度之后，您需要做的第一件事情，就是为表达丰度低的标记物选择合适的荧光染料。基于抗原密度的荧光选择，有助于改善待检测细胞群的分辨率。


图 2：可以看到相同克隆的 CD56 偶联不同荧光染料，CD8 和 CD56 双染色结果的细胞分群分辨率是不一样的。亮度弱的 A700 和 FITC 的细胞分群不如 A488 和 PE 明显。由此说明了荧光亮度对于流式分群染色的结果的影响。

在掌握了前两个基本原则，开始设计多色方案的时候，你可能会发现，检测方案中包含的标记物越多，荧光染料的选择就越焦头烂额。因为，荧光强度高的染料可能会有更大的荧光扩散。此外，荧光染料可能还存在交叉激光激发，例如 APC 可以被 405 nm 紫光激光器和 640 nm 红光激光器激发。而无论是交叉激光激发还是荧光光谱的重叠，均影响了荧光溢出和补偿。最后，尽量避免补偿，尽可能地避免染料的发射谱图的重叠或者使重叠最小化。

重要提示：

StarBright 高亮染料经过优化，具有荧光光谱的发射谱图峰值窄的优势，从而使您轻松实现发射谱图的最小化。由此可以轻松选择染料，在 18 色的 Panel 里可同时使用高达 11 个 StarBright 染料。


重要提示：

两种情况请慎用 Cy 系列的串联染料：

1、如果您的流式方案涉及固定和破膜的需求，比如胞内细胞因子染色，就需要尽量避免 Cy 系列的染料，而采用 StarBright 染料或者 RPE-Alexa Fluor® 750 等染料，因为 Cy 系列的染料对固定敏感，会影响染色结果。

2、对于单核细胞的染色，您需要避开 PE-Cy5 系列的串联染料，而选择 RPE-Alexa Fluor® 647 等其他染料。因为 PE-Cy5 系列串联染料已经证实具有非特异性结合的问题，导致染色结果的偏差。


图 3：数据来自发表在流式界权威期刊 Cytometry 的一篇文章：Behold Cytometrists: One Block Is Not Enough! Cyanine-Tandems Bind Non-Specifically to Human Monocytes，Mie W. Kristensen。可以看到 B 图中红色箭头标识的 PE-Cy7 系列单核细胞结果和预期不一致，出现了阳性信号；而 C 图和 D 图中红色箭头标识相同克隆的 CD206 抗体偶联 APC 和 PE 时，单核细胞的 CD206 染色结果和预期一致。系列实验提示 PE-Cy7 串联染料非特异性结合单核细胞，造成了结果的不准确。

3. 排除不需要的细胞群

您可能会认为，FSC 和 SSC 可以反映细胞的物理特性，区分细胞死活状态，从而排除死细胞对于染色结果的影响。但是事实上，由于死细胞会增加非特异性结合和自发荧光，从而导致假阳性的产生。因此，FSC/SSC 对于死细胞的排除并没有预期的那么有效。


图 4：A 和 B 并没有加入死活染料，而是直接根据 FSC/SSC 进行 CD11b PB 和 Gr-1 FITC 分析；而 C 和 D 加入了死活染料，先圈门了活细胞，然后对于活细胞进行了 CD11b PB 和 Gr-1 FITC 分析。你会发现两者的结果差异很大，而基于活细胞进行的间质干细胞分析结果更准确，因为去除了很多死细胞造成的干扰。

对于仅检测表面标记物的多色方案，活性染料的选择有很多，你可以选择胞膜不可渗透的核酸染料（例如：DAPI、Bio-Rad ReadiDrop PI 和ReadiDrop 7-AAD）和胞膜不可渗透的蛋白染料（例如：Bio-Rad VivaFix）；而对于包含胞内细胞因子染色的多色方案，您只能选择胞膜不可渗透的蛋白染料 VivaFix（Bio-Rad）。

重要提示：

蛋白结合染料 VivaFix（Bio-Rad）的优势是：一旦细胞被 VivaFix 染色，它们可以被固定（也可以在不固定时使用），并且固定并不会降低活细胞和死细胞之间的分辨率。此外，与 DNA 结合染料相比，它们具有更广泛的激发和发射光谱范围选择，大大扩展了多色流式方案的选择和提升了染料搭配的灵活性。


图 5：蛋白质结合活力染料。A. 染料与表面伯胺结合的活细胞。B. 染料与表面和细胞内伯胺结合的死细胞。


图 6：VivaFix 活性染料（Bio-Rad）染色结果。Jurkat 细胞用 VivaFix 498/521 染色，A）用 3.7% 甲醛固定或 B）不固定。用 S3™ 细胞分选仪器（Bio-Rad）检测。可以看到两个结果均显示活细胞和死细胞间有很好的区分。

除了活性染料，Dump Channel也是多色流式方案中的一个技巧。Dump Channel（转储），可以放置不感兴趣的细胞标记物从而在分型中忽略这些细胞群，这对于稀有细胞的分析非常有帮助。举个例子，在鉴定小鼠造血干细胞时，可以把谱系标记（B220，CD3，Ter119，GR-1，CD11b）放入 Dump Channel，从而在进一步分析中排除这些标记。

除了上述两个方面，由于流式细胞仪无法区分信号是来自单个细胞还是同时被检测的多个细胞，因此排除粘连体在分析中也是需要考虑的重要方面。

去粘连体的原因有三个：

1

如果粘连体中的两个细胞结合相同的荧光抗体，则面积信号会比单个阳性细胞显得更亮；

2

当粘连体包含一个阳性细胞和一个阴性细胞时，粘连体会产生假阳性，导致纯度降低；

3

可能会得到奇怪的染色结果，例如，如果粘连体由 B 和 T 细胞组成，它们将同时显示为 CD3+ 和 CD19+。

粘连体的面积信号和宽度信号是单个细胞的两倍，而高度信号两者大致相同，因此可以通过前向散射或侧向散射信号绘制高度 vs. 宽度或面积的图来排除粘连体。

4. 使用适当的对照

不同的实验需要不同的实验对照。常见的FMO（荧光减一）对照可以定义阳性群体的圈门，未染色的细胞可以用来确定样本中的荧光背景或自发荧光的水平。

同型对照可以帮助您确认特异性染色，从而去除非特异结合。Fc 封闭对照在进行具有 Fc 受体的细胞群体的研究时尤为重要，这些细胞群体包括巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞等。


图 7：J774 巨噬细胞在含有 CD11b FITC （MCA74F）和 IgG2b Alexa Fluor®647 （MCA6006A647）的 PBS w/v1% BSA 中，4 ℃ 染色 30 分钟。a）在没有 Fc 或 b）有小鼠Seroblock FCR（BUF041A）及 c）有小鼠Seroblock FCR（BUF041A）同时进行 F4/80 A647（MCA497A647）特异性染色。a 图中圆圈圈出的 A647 阳性细胞是 Fc 结合，在 Fc 被封闭后就消失了。从而可以确保 c 图中的特异性染色的准确性。所有的数据均基于 7-AAD 染色阴性的圈门分析，已经进行了去粘连体和去死细胞的圈门。

其他的实验对照还有生物对照，用于确定染色特异性和实验限制，比如胞内细胞因子染色时会设置胞内染色对照用于确定非特异性染色，而设置单染和补充对照是为了通过软件进行自动补偿调节。

重要提示：

同型对照已针对表面染色进行了优化，对于胞内染色，无论是抗体还是荧光染料结合胞内成分均会影响胞内染色。因此可能需要荧光染料的选择和其他的对照。

重要提示：

减少非特异性抗体结合的常见方法：

● 阻断 Fc 受体

● 在缓冲液中加入过量的蛋白质，例如 BSA

● 抗体滴定

● 使用活/死标记排除死细胞

5. 优化您的设置

为了确保您拿到出色的结果，需要对检测设置格外小心。样本制备是关键步骤，样本处理不当会导致大量细胞死亡或者濒死。一些简单的细节就有可能对结果产生重点的影响，比如使用新鲜或冷冻的样本或您是否需要去除红细胞。最后，在开始之前，请确保已经理清如何分析数据的思路，帮助、计划圈门策略，进而获得准确的实验结果。

重要提示：

直方图会隐藏小细胞群体，使数据看起来比实际的更漂亮。意识到这一点，除了细胞周期和增殖分析外，期刊有时更倾向于用双参数（如散点图等）图来显示数据。下图就展示了相同数据不同图的差异：


图 8：人外周血 B 细胞的鉴定。用死活染料、CD19 AMO、IgD FITC 和 CD27 A647 对红细胞裂解的外周血进行染色。在 ZE5 细胞分析仪上获取数据。对单个活的 CD3- CD19+ 细胞进行圈门分析，在双参数图上可以检测到多个 B 细胞亚群：幼稚 B 细胞（CD27- IgD+）、非类别转换记忆细胞（CD27+ IgD+）、类别转换记忆细胞（CD27+ IgD-）。

6. 了解您的仪器并优化仪器设置

对于多色流式实验，染色指数是其中一个非常重要的方面，前面提到的为表达弱的标记物选择亮的染料，是为了确保染色指数。在落实了前面所有的工作，确定了多色检测方案里的配色，真正开展流式实验，您还剩下一个步骤，就是进一步优化染色指数：抗体滴度和电压优化。



图 9：您需要进行抗体滴度，寻找染色指数最优的抗体浓度。

除了抗体滴度实验，另一个往往被很多人忽略的细节，就是流式细胞仪仪器的PMT（光电倍增管）的电压设置会影响检测的染色指数。因此，优化实验的电压，找到最优的电压范围对获得高质量的数据至关重要。优化实验的电压的方法非常简单，就是用单染样本或者单染微球上样，逐步增加电压的值。


图 10：增加电压，计算染色指数。染色指数最优，同时阴性群没有出现峰宽扩展，往往为最优的电压，在这个例子里就是 600 V.

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