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仪器知识 PCR (polymerase chain reaction)聚合酶链式反应的发展

2022年07月19日


PCR技术
PCR (polymerase chain reaction)聚合酶链式反应，是体外DNA扩增技术之一，至今已经超过30年的历史。
PCR技术于1983年由美国Cetus公司的KaryMullis首创，1985 年Mullis申请了PCR专利，同年在Science上发表了第一篇PCR 学术论文，1993 年Mullis因此获得了诺贝尔化学奖。
PCR基本原理
PCR可以将目标DNA片段扩增一百万倍以上，其原理是在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
标准 PCR 过程分为三步：
1.变性（Denaturation）：利用高温使DNA 双链分离。DNA双链之间的氢键在高温下（93- 98℃）被打断。
2.退火（Annealing）：在 DNA 双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA 上。
3.延伸（Extension）：DNA 聚合酶由降温时结合上的引物处开始沿着DNA 链合成互补链，延伸完成，则完成一轮循环，DNA片段数增加一倍。

往复循环这三个步骤25-35 次，DNA 片段数将得到指数级增加。

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PCR的巧妙之处在于针对不同的目标基因可以设计不同的引物，使目标基因片段在短时间内得到百万级的放大。
目前为止，PCR可以分为三类，分别是普通PCR、荧光定量PCR和数字PCR。
第一代普通PCR
采用普通PCR 扩增仪来对靶基因进行扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，只能做定性分析。
第一代PCR主要缺点：
容易发生非特异性扩增和假阳性结果。
检测耗时长，操作繁琐。
只能做定性检测。
第二代荧光定量PCR
荧光定量PCR（Real-Time PCR），也叫做qPCR，通过在反应体系中加入能够指示反映进程的荧光探针，通过荧光信号的积累来监测扩增产物的积累，通过荧光曲线来判断结果，并可以借助Cq 值和标准曲线来定量。
qPCR 技术由于操作过程在封闭体系中进行，降低了污染概率，并且可以通过对荧光信号监测从而进行定量检测，因此临床应用最为广泛，已成为PCR中的主导技术。
实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为：TaqMan荧光探针、分子信标和荧光染料。
1)TaqMan荧光探针：
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
2)SYBR荧光染料：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。

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3)分子信标
是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。
PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。
第二代PCR主要缺点：
灵敏度还有欠缺，低拷贝标本检测不准确。
存在背景值影响，结果易受干扰。
当反应体系中有PCR抑制物时，检测结果易受干扰。
第三代数字PCR
数字PCR（DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR）通过终点检测计算目标序列的拷贝数，无需采用内参和标准曲线即可进行精确的绝对定量检测。
数字PCR采用终点检测，不依赖于Ct值（循环阈值），所以数字PCR反应受扩增效率的影响降低，对PCR反应抑制物的耐受能力提高，具有很高的准确度和重现性。
由于具备高灵敏度、高精确度的特点，不易被PCR反应抑制剂干扰，无需标准品可实现真正意义的绝对定量，而成为研究和应用热点。
根据反应单元的不同形式，主要可分为微流体式、芯片式和微滴式三大类系统。
1)微流体数字PCR，Microfluidic digital PCR，mdPCR。
基于微流控技术，对DNA模板进行分液，微流控技术能实现样品纳升级或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再与PCR反应体系结合，mdPCR已逐渐被其他方式取代。
2)微滴数字PCR，Droplet-based digital PCR，ddPCR。

利用油包水微滴生成技术对样品进行微滴化处理，将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。

第三代PCR主要缺点：
仪器和试剂昂贵。
模板质量要求较高，模板量超过微体系量将导致无法定量，过少则定量准确度降低。
当存在非特异性扩增时也会产生假阳性。
PCR的各种延伸技术
1.递减PCR（touchdown PCR）：前几循环温度逐渐下降。
2.逆转录PCR（RT-PCR）：以由mRNA逆转录而来的cDNA 为模板，也因为是从表现型基因来进行增量的，由此产生出来的cDNA 产物不带有内含子（基因中不具意义的段落），常应用于分子克隆技术。
3.热启动PCR（hotstart PCR）：以高热激活型核酸聚合酶进行反应，减少非专一性产物。
4.巢式PCR（nested PCR）：先用低特异性引物扩增几个循环以增加模板数量，再用高特异性引物扩增。
5.多重PCR（multiplex PCR）：在同一个管中使用多组引物。
6.复原条件PCR（reconditioning PCR）：PCR 产物稀释 10 倍后重新放入原浓度的引物和dNTP 等循环 3 次，以消除产物中的异二聚体。
7.dsRNA 合成（dsRNA replicator）：合并使用high-fidelity DNA polymersae、T7RNA聚合酶与Phi6 RNA replicase；从双股 DNA转录为对应的双股RNA（dsRNA）。可应用于RNAi实验操作。
8.COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature PCR):用以检测突变或特殊等位基因的PCR 应用技术。


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